改良大鼠毛囊干细胞体外培养鉴定及诱导分化的研究

摘要：目的：探讨改良体外分离、培养、扩增、纯化 SD 大鼠毛囊干细胞(rHFSCs)及其免疫、超微结构的鉴定方法,观察 rHFSCs 的生物学特性及成脂、成骨分化能力。方法2015年1—6月选取清洁级1周龄 SD 大鼠6只,在无菌条件下切取 SD 大鼠触须部皮肤,用 Dispase 酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化,显微镜下分离毛囊隆突部,用梯度加液组织块贴壁法培养 rHFSCs,用两步酶消化法传代,用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化 rHFSCs。收集第3代 rHFSCs,采用流式细胞术、免疫荧光染色及透射电镜观察 rHFSCs 内部结构等方法鉴定 rHFSCs。收集第1~10代 rHFSCs 检测细胞活力,第3、5、7、9代rHFSCs 培养第1~8天时检测细胞增殖能力。收集第3代 rHFSCs,按培养液的不同分为诱导组和对照组,对比两组目的基因 PPAR-γ、C/ EBPa、OPG、Runx2的相对表达量及染色后的光密度(OD)值变化情况,观察 rHFSCs 的成脂、成骨分化能力。结果通过改良方法分离、培养、纯化的 rHFSCs 呈典型的铺路石状,生长曲线呈“S”形,生长增殖能力良好,克隆形成能力强。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞术检测显示 Integrin β1、Integrin α6、P63呈高表达,CK15呈中等表达,符合 rHFSCs 标记鉴定特点。免疫荧光染色和透射电镜观察 rHFSCs 内部结构证明细胞的类型属于毛囊干细胞。rHFSCs 成脂诱导培养7 d 后 RFqPCR 定量结果显示,诱导组目的基因 PPAR-γ、C/ EBPa 的相对表达量(5.598±0.168、4.757±0.416)均明显高于对照组(1.119±0.344、1.126±0.355),差异均有统计学意义(t =34.955、20.266,P 值均<0.01)；诱导14 d 后细胞油红 O 染色阳性,诱导组 OD 值(2.472±0.091)明显高于对照组(0.817±0.003),差异有统计学意义(t =114.641, P <0.05)。 rHFSCs 成骨诱导培养14天后 RFqPCR 定量结果显示,诱导组目的基因 OPG 和 Runx2的相对表达量(1.921±0.275,3.892±0.265)明显高于对照组(1.085±0.288,1.046±0.216),差异均有统计学意义(t =4.667、17.332, P 值均<0.01)；诱导21 d 后细胞茜素红染色阳性,诱导组 OD 值(0.716±0.016)明显高于对照组(0.076±0.002),差异有统计学意义(t =14.078, P <0.01)。结论采用改良体外分离、培养、扩增、纯化方法可成功建立 rHFSCs 体外培养体系,rHFSCs 具有纯度大、增殖效率高、多向分化潜能强等特点,可为干细胞组织工程学相关发展提供良好的种子细胞。